Microscopio óptico común (MO)
Es también llamado
microscopio de campo claro o microscopio fotónico, ya que se utiliza un haz de luz común (luz blanca) que atraviesa la muestra biológica e ilumina el campo de observación.
El MO consiste básicamente en una asociación de tres sistemas de lentes: el condensador, que enfoca los rayos de luz sobre la muestra; los objetivos que magnifican la imagen, y los oculares que agregan una mayor magnificación y permiten la visualización de la imagen lograda. Se obtiene una imagen final virtual, invertida y aumentada de los objetos observados.
Los sistemas de lentes y otros componentes relacionados constituyen la parte óptica del MO, el cual también consta de una parte mecánica que hace posible su funcionamiento.
Los componentes de la parte mecánica son:
El pie, que debe ser lo suficientemente pesado y amplio como para brindar estabilidad.La columna, que se articula con el pie y en algunos modelos puede inclinarse.El tubo, que lleva en su extremo superior el/los ocular/es y en su parte inferior un sistema de revólver porta-objetivos.La platina, superficie dispuesta perpendicularmente al eje óptico del microscopio, sobre la cual se coloca la preparación a observar. En el centro de la platina hay un orificio por el que pasan los rayos luminosos atravesando la preparación. Esta se sujeta con un par de pinzas a un dispositivo móvil que permite desplazada en sentido lateral o anteroposteriorLos tornillos de control macrométrico y micrométrico permiten enfocar la preparación a observar. Estos tornillos pueden estar ubicados de diferente manera, y producen un movimiento vertical ya sea del tubo o de la platina, de acuerdo al modelo de microscopio. El tornillo macrométrico determina un desplazamiento rápido, de centímetros o milímetros, para el enfoque inicial, mientras el micrométrico brinda un movimiento de unos pocos micrómetros para ajustar el enfoque.
La parte óptica del microscopio comprende:
Una fuente de iluminación, preferentemente luz artificial, que puede estar incorporada al pie del aparato o ser ajena a él, en cuyo caso se recibe por medio de un espejo que la refleja hacia la platina. El espejo generalmente tiene dos caras, una cóncava y una plana; esta última es la que se utiliza cuando se trabaja con condensador y luz artificial.El condensador está ubicado bajo la platina. Está constituido por un sistema de lentes convergentes que condensan los rayos luminosos y los proyectan en forma de un amplio cono que atraviesa el preparado. El condensador puede desplazarse en forma vertical, acercándolo m
ás al preparado cuanto mayor sea el aumento del objetivo que se use.Un diafragma iris (diafragma de apertura), ubicado debajo del condensador, gradúa la luz para ajustar el contraste de la imagen. Básicamente, este diafragma debe estar más cerrado cuanto menor contraste presenten las estructuras a observar, si se trata de preparaciones histológicas bien teñidas y contrastadas es preferible que esté abierto.Los objetivos, de diferentes aumentos, se pueden acomodar uno a uno sobre el preparado, moviendo el sistema de
revólver porta-objetivos. En la periferia de cada objetivo están grabadas varias cifras que indican el aumento, la apertura numérica, la longitud del tubo del microscopio y el espesor deseable del cubreobjetos del preparado. Corrientemente los MO están provistos de un objetivo de bajo aumento (de 3,5 ó 5 X), otro de 10 X, uno de gran aumento (45 X) y uno de inmersión (100 X). La magnificación proporcionada por este último objetivo requiere que entre la lente frontal del mismo y el cubreobjetos de la preparación se interponga un líquido de igual índice de refracción que el vidrio, para que los rayos de luz no se desvíen y la imagen no sufra deformaciones. Para ello se coloca una gota de aceite de cedro entre el objetivo de inmersión y la preparación.El/los ocular/es son las lentes a través de las cuales se observa la preparación histológica. Hay microscopios monoculares y binoculares. Los oculares recogen la imagen proyectada por el objetivo, y la amplían. Generalmente se utilizan oculares que proporcionan un aumento de 10 X. El aumento final obtenido es el resultado del producto del aumento del ocular por el aumento del objetivo.
Manejo y cuidado del MO:
Los MO deben transportarse con precaución, en posición vertical, evitando golpes. Deben permanecer correctamente apoyados, y cuando no se usan deben cubrirse con su funda o estuche. Se puede quitar el polvo depositado sobre las piezas ópticas, con un chorro de aire y/o un pincel de pelo, seco. La grasitud de los oculares puede eliminarse con un papel especial o un trozo de tela de algodón seca.
Para lograr la observación adecuada de una preparación se requiere una correcta iluminación y un enfoque preciso. Generalmente se utilizan preparados histológicos, en los que una delgada porción del material biológico está colocado sobre una fina lámina de vidrio llamada portaobjetos, y cubierto por una lámina más delgada aún, el cubreobjetos.
Para la observación se procede de acuerdo a los siguientes pasos:
Lograr una correcta iluminación. Si la fuente de luz es externa al MO, debe moverse el espejo de manera que el haz de luz atraviese el orificio de la platina. Controlar que el diafragma de apertura esté abierto y el condensador en posición baja, al comenzar las operaciones. (Durante la observación se irá variando la iluminación).
Colocar el preparado sobre la platina, sujetándolo bien. El cubreobjetos siempre debe quedar hacia arriba. Ubicar el material a observar sobre el orificio de la platina.
Iniciar la observación con el objetivo de menor aumento, que brindará una visión panorámica del material. Al comenzar a trabajar, el objetivo debe estar retirado de la preparación.
Enfocar, acercando el objetivo a la preparación por medio del tornillo macrométrico, hasta obtener una imagen, aunque ésta sea borrosa. Ajustar el enfoque con el control micrométrico, hasta que la imagen sea perfectamente nítida.
Recorrer el preparado reconociendo sus características y seleccionando el campo que se observará con mayor magnificación.
Al cambiar a un objetivo de mayor aumento, deberá corregirse ligeramente el enfoque con el tornillo micrométrico. Esta operación deberá ser realizada con mucha precaución, porque la lente frontal de los objetivos de mayor aumento se ubica muy próxima a la superficie del preparado, y una maniobra brusca podría romperlo.
Al utilizar el objetivo de 45 X, colocar el condensador en su posición más alta, para concentrar la luz sobre el pequeño campo que abarca este objetivo y poder distinguir correctamente las estructuras.
No utilizar el objetivo de inmersión en seco.
Mientras se observa con grandes aumentos, es conveniente mover continuamente, el control micrométrico para realizar un "barrido" de todo el espesor del corte, ya que usualmente los cortes histológicos tienen un espesor de 5 a 10 m.
Características de la observación con MO común:
La utilidad del MO reside en su capacidad de magnificación y en su poder de resolución. La magnificación depende del aumento que proporcionan las lentes de los objetivos y oculares; entre ambos pueden aumentar la imagen 1.000 o 1.500 veces. El poder de resolución (o sea, la capacidad para producir imágenes separadas de objetos que se encuentran muy próximos), no depende solamente del sistema óptico sino también de la longitud de onda de la luz (que en la luz visible va desde 0,4 a 0,7 m, del violeta al rojo). Cuanto menor sea la longitud de onda utilizada, el poder de resolución será mayor. Con una luz que tenga una longitud de onda de 0,45 m, obtenida a partir de la luz blanca que pase por un filtro verde, y con objetivos y condensadores adecuados, el poder de resolución máximo que puede alcanzar el MO estaría alrededor de los 0,2 m. Este es un límite teórico máximo, que generalmente no se alcanza en condiciones normales de trabajo. Usando lentes más potentes o proyectando la imagen en una pantalla, se podría incrementar el aumento pero no se mejoraría el poder de resolución.
La muestra que se observa en el MO de campo claro debe ser lo bastante fina como para que la luz pueda atravesarla. Los detalles tisulares o celulares que se visualizan se deben a las diferencias de absorción de la luz en las distintas partes del material biológico; como las células son prácticamente transparentes a la luz blanca, el contraste se intensifica mediante métodos de tinción de la preparación a observar. El MO brinda imágenes en un sólo plano, pero para su interpretación debe tenerse en cuenta la conformación tridimensional de las estructuras que se observan.
Con las menores magnificaciones del MO de campo claro se puede distinguir la organización de los tejidos en un órgano y de las células y el material extracelular en un tejido; con los mayores aumentos se llegan a visualizar las principales estructuras de las
células eucariotas:
se diferencian el citoplasma y el núcleo, y dentro de éste el nucleolo y las masas de cromatina. Con tinciones especiales puede distinguirse en el citoplasma la presencia de algunos orgánulos, sin mayor detalle de los mismos. También se llega a observar el contorno de las células procariotas, pero no se puede ver la estructura interna de estas células, ni los detalles más finos de las células eucariotas. Una bacteria, o una mitocondria, están prácticamente en el límite de resolución de este microscopio.
